Saznajte što su to NIPT – genetički neinvazivni prenatalni testovi i po čemu se razlikuju

28.02.2017 / Piše dr. med. Bojan Smrzlić

Potrebno je znati da su genetički NIPT-ovi koji se nude na tržištu slični, no da ipak nisu jednaki. Zbog toga je prilikom odabira testa potrebno obratiti pažnju na nekoliko ključnih stvari koje ih razlikuju

Prenatalna dijagnostika obuhvaća niz dijagnostičkih postupaka kojima se ispituje postojanje bolesti ili patološkog stanja kod ploda. Ovi postupci, kao i standardne neinvazivne metode probira, su opisani na stranicama web portala Mamatataja.hr, u članku 12. tjedan trudnoće, u rubrici Trudnoća po tjednima, pa ćemo se ovdje osvrnuti samo na genetičke neinvazivne prenatalne testove probira.

Što trebate znati kod odabira neinvazivnog prenatalnog testa?

Otkrićem prisutnosti slobodne fetalne DNA u cirkulaciji trudnice 1997. godine, neinvazivno prenatalno testiranje postalo je jedno od najdinamičnijih područja istraživanja u medicini. Napredak tehnologije te kliničke studije dovele su do razvoja suvremenih genetičkih neinvazivnih prenatalnih testova (NIPT). Iako imaju iznimno visoku stopu detekcije određenih sindroma već od 9. gestacijskog tjedna, NIPT-ovi se još uvijek ne smatraju dijagnostičkim testovima i najčešće se primjenjuju kao testovi probira, zajedno s tradicionalnim probirnim protokolima ili nakon njihove provedbe.

Usprkos svim naporima uloženim u razvoj biokemijskih testova probira (kombinirani prenatalni test), njihova stopa lažno pozitivnih rezultata iznosi od 1.9 do 5.2 posto, a lažno negativnih od 12 do 23 posto, zbog nedovoljne osjetljivosti i specifičnosti testova. Upravo je stopa lažnih pozitivnih/negativnih nalaza jedan je od razloga koji su potaknuli razvoj genetičkih neinvazivnih prenatalnih testova (NIPT).

Nisu svi genetički prenatalni testovi jednaki

Budući da broj i vrsta komercijalnih genetičkih neinvazivnih prenatalnih testova na tržištu bilježe konstantan porast, potrebno je razumjeti da su genetički NIPT-ovi slični, no da ipak nisu jednaki. Zbog toga je prilikom odabira testa potrebno obratiti pažnju na nekoliko ključnih stvari koje ih razlikuju.

Različite metode sekvenciranja DNA

Ono što razlikuje testove su različiti pristupi sekvenciranja DNA, odnosno određivanja redoslijeda gradivnih elemenata DNA, nukleotida. Osim tvrtke Ariosa koja NIPT provodi nešto starijom metodom sekvenciranja na mikročipovima, većina tvrtki koristi masovno paralelno sekvenciranje čitavog genoma. Tvrtka Natera je uvela suvremeniju metodu kojom se ciljano sekvenciraju promjene jednog nukleotida (eng. single nucleotide polymorphism, SNP).

Svaka od navedenih metoda daje različitu količinu podataka, a različite su također i biostatističke metode kojima se dobiveni podatci obrađuju i temeljem kojih se interpretiraju dobiveni rezultati analize. Sve su to čimbenici koji utječu na postotak stvarno pozitivnih i negativnih nalaza. Širi opis razlika metoda možete pročitati na www.genos.hr.

Pozitivna prediktivna vrijednost – bitan parametar po kojem se testovi razlikuju

Na službenim stranicama pojedinih testova često se navode dva parametra, osjetljivost i specifičnost testa, koji iznose preko 99 posto. Uglavnom svi NIPT-ovi imaju slične ove dvije vrijednosti, međutim u obzir treba uzeti i mogućnost javljanja lažno pozitivnih i negativnih nalaza. Ona je uvijek prisutna, budući da se radi o testovima probira, a ne dijagnostičkim testovima. Stoga je pozitivna prediktivna vrijednost (PPV) bitan parametar po kojem se testovi razlikuju.

Pozitivna prediktivna vrijednost (PPV) je vjerojatnost da pozitivan test uistinu predstavlja prisutnost bolesti/stanja, a definirana je kao omjer broja stvarno pozitivnih nalaza i broja svih pozitivnih nalaza. Na njega mogu utjecati određeni čimbenici, npr. prevalencija bolesti. Veći PPV može biti bolji pokazatelj za učinkovitost samog testa. Tako PPV, ovisno o testu na tržištu, iznosi od 33 do 95 posto za trisomije 13, 18, 21 (Patau, Edwards i Down sindrom). Za mikrodelecije kromosoma PPV iznosi od 12 do 60 posto, što je razlog preporuke ciljanog testiranja ukoliko postoji saznanje o ovakvim stanjima u obitelji. Jako je važno koristiti testove koji su klinički validirani tj. koji su testirani i promatrani kroz kliničke studije.

Razlike i po potrebnoj fetalnoj frakciji – udjelu fetalne DNA u cirkulaciji trudnice

Točnost neinvazivnog prenatalnog testiranja ovisi i o fetalnoj frakciji (udio fetalne DNA u cirkulaciji trudnice) i prema smjernicama struke mora biti iskazana na nalazu. Zbog metode kojom se određuje, donja granična vrijednost fetalne frakcije razlikuje se među komercijalno dostupnim testovima. Zbog oko četiri puta većeg broja SNP koji se analiziraju u svrhu određivanja fetalne frakcije, za Nateru je dovoljna fetalna frakcija od 2.8 posto da bi rezultati analize bili relevantni, dok je za ostale tvrtke potrebna fetalna frakcija od minimalno 4 posto.

Mogućnost analize uzoraka s niskim udjelom fetalne DNA važna je jer fetalna frakcija varira od trudnice do trudnice pošto ovisi o raznim čimbenicima (gestacijska dob, indeks tjelesne mase trudnice, tip aneuploidije, višeplodnost, mozaicizam, uzimanje antikoagulantnih lijekova). Zbog tako niske granice fetalne frakcije, za razliku od drugih tehnologija, SNP tehnologijom je moguće provesti test već od 9. tjedna trudnoće.


Fetalna frakcija

Analiza rezultata

Nemogućnost odvajanja fetalne od majčine slobodne DNA predstavlja glavni analitički problem i ograničavajući faktor za širu primjenu analize slobodne fetalne DNA iz plazme trudnice. Niti jedan NIPT ne testira samu fetalnu DNA.

Masovno paralelno sekvenciranje čitavog genoma se temelji na sekvenciranju i brojanju očitanih sekvenci DNA fragmenata iz plazme. Metodom tzv. poravnavanja očitane sekvence se dodjeljuju odgovarajućem kromosomu, a zatim se uspoređuje omjer broja očitanih sekvenci ciljnog kromosoma i ukupnog broja svih očitanih sekvenci. Dobiveni omjer se nakon toga uspoređuje sa omjerom kod referentnih kontrolnih uzoraka (biostatistička analiza).

Za razliku od gore navedene analize, SNP metoda se temelji na usporedbi konkretnih genotipova dobivenih analizom specifičnih DNA biljega (SNPs – promjenjivi dijelovi DNA po kojima se osobe razlikuju i koji se nasljeđuju od roditelja). Ovom metodom analizira se i majčina DNA. Iz podataka dobivenih za ukupnu slobodnu DNA (majčina+fetalna) mogu se „isključiti“ oni koji pripadaju majci. Dakle test može razlikovati koji se podatci odnose na majčinu, a koji na fetalnu DNA. Ovakav pristup rezultira manjim brojem lažno pozitivnih/negativnih nalaza naspram ostalih metoda te omogućava utvrđivanje poremećaja broja kromosoma uzrokovanog triploidijom ili nestalim blizancem (eng. vanishing twin).

Višestruke trudnoće su također jedan od razloga netočnog rezultata. Na primjer, u slučaju dizigotnih blizanaca fetalna frakcija po pojedinom fetusu bit će niža. Kod višestruke trudnoće se ne preporuča raditi NIPT jer za sad niti jedna metoda ne može utvrditi kolika je fetalna frakcija pojedinog blizanca čime se povećava mogućnost javljanja lažno pozitivnih/negativnih nalaza.

Kako izabrati među NIPT-ovima?

Najvažnija prednost neinvazivne prenatalne dijagnostike je, kao što joj i ime kaže, neinvazivnost. Svaki invazivni zahvat ima rizik za plod i majku. Ovi testovi se, za razliku od klasičnih probira, mogu napraviti tijekom cijele trudnoće, budući da razina fetalne DNA u majčinoj krvi raste s razvojem ploda. Rezultat testa uvijek treba promatrati uz ostale kliničke pokazatelje, posebno nalaz ultrazvuka. Ultrazvučna dijagnostika je i dalje jako važna kao komplementarna metoda prenatalne dijagnostike u svrhu isključivanja strukturnih fetalnih anomalija.

Iznimno je važno razumjeti mogućnosti ovih testova i područje njihove primjene, kako od strane medicinskog osoblja, tako i od strane budućih roditelja. Na tržištu se pojavljuju testovi koji nisu validirani tj. nemaju nikakvu kliničku podlogu. Prilikom uspoređivanja rezultata provedenih studija treba obratiti pažnju na niz kriterija, kao i na stopu ponavljanja testa te broj testova koji nisu dali rezultat. Zbog svega navedenog, NIPT-ovi se ne bi smjeli provoditi bez adekvatnog genetičkog savjetovanja ili konzultacije s ginekologom koji će moći objasniti prednosti i ograničenja ove vrste testiranja te dati daljnje smjernice nakon dobivenih rezultata.